Purification engineering technology research center of Sichuan Province Natural Medicine
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类异戊二烯

  第四节 RNA的构造与效力 Structure and Function of RNA ? RNA是DNA的转录产品。 ? RNA与卵白质联合卖力基因的外达和外达流程的调 控。 ? RNA日常以单链线性式样存正在,可是能够通过链内 的碱基互补配对造成限度的双螺旋构造,进而造成 三级构造。 ? 与DNA比拟,RNA的品种、巨细、构造以及安静性 出现出了众样化,这与它们的效力众样化亲密闭系。 真核细胞内紧要RNA的品种和效力 品种 信使RNA messenger RNA (mRNA) 细胞定位 效力 细胞核、细胞质、 卵白质的合成模板 线粒体 成熟mRNA的前体 非均一核RNA heterogeneous nuclear RNA 细胞核 (hnRNA) 转运RNA transfer RNA (tRNA) 核糖体RNA ribosomal RNA (rRNA) 非编码小RNA small non-coding RNA (sncRNA) 细胞核、细胞质、 转运氨基酸 线粒体 细胞核、细胞质、 组成核糖体 线粒体 细胞核、细胞质 参预hnRNA的剪接和 转运、rRNA加工、 基因外达调控等 一、mRNA是卵白质合成中的模板 ? 信使 RNA(messenger RNA, mRNA) 是合成蛋 白质的模板。 ? 不均一核RNA(hnRNA)含有内含子(intron)和外 显子(exon)。 ? 外显子是氨基酸的编码序列,而内含子短长编 码序列。 ? hnRNA历程剪切后成为成熟的mRNA。 ? mRNA成熟流程 内含子 (intron) 外显子 (exon) hnRNA mRNA ? 成熟的真核生物mRNA 编码区 AUG UAA 3 AAA……An 5 7 m Gppp 5非翻译区 3非翻译区 ? 从 AUG 开头,每三个核苷酸为一组编码了一个氨基酸, 称为三联体暗码(codon)。 ? 成熟的mRNA由氨基酸编码区和非编码区组成。 ? 5′-终局的帽子(cap)构造和3′-终局的众聚A尾(poly-A tail) 构造。 (一)大局限线-甲 基鸟嘌呤-三磷酸核苷为开始构造 ? 帽子构造:m7GpppNm OH OH H H H H O 5 CH2 O O O - NH2 O P O - O O P O - N O 5 CH2 H H O O H 3 2 N N N H2N HN N N N P O O CH3 H OCH3 mRNA 的 帽 结 构 可 以 与 帽 结 合 蛋 白 (cap binding protein,CBP)维系。 线-甲基鸟嘌呤核苷帽状构造及核糖甲基化 (二)正在线;终局有众聚腺 苷酸构造 线′-终局转录后加上 一段是非纷歧的聚腺苷酸。 帽子构造和众聚A尾的效力 mRNA核内向胞质的变动 mRNA的安静性维系 翻译开始的调控 一条无缺的 mRNA 征求 5 ′- 非编码区、编码区和 3 ′ - 非 编码区。 编码区征求开始暗码子、编码氨基酸的序列和终止密 码子。 原核细胞 真核细胞 细胞质 细胞核 DNA 转录 外显子 内含子 DNA 转录 hnRNA mRNA 翻译 卵白 转录后剪接 转运 mRNA 翻译 卵白 (四)mRNA的成熟流程是hnRNA的剪接流程 卵清卵白mRNA的成熟 二、tRNA是卵白质合成中的氨基酸载体 ? 转运 RNA(transfer RNA, tRNA) 正在卵白质合成 流程中动作各式氨基酸的载体 , 将氨基酸转呈 给mRNA。 ? 由74~95核苷酸构成; ? 占细胞总RNA的15%; ? 具有很好的安静性。 (一) tRNA分子含有罕睹碱基 ? 含 10 % ~20% 罕睹碱基,如 DHU ? 3′终局为 — CCA-OH ? 5′终局大大批为G ? 具有 TψC O N NH N NH N 罕睹碱基 CH3 O H H H H NH NH O N,N二甲基鸟嘌呤 HN N NH N CH2 N CH3 CH C CH3 CH3 双氢尿嘧啶 S NH NH O N6-异戊烯腺嘌呤 4-巯尿嘧啶 tRNA中常睹的罕睹碱基 (二)tRNA具有茎环构造 ?tRNA 具 有 局 部 的 茎 环(stemloop)构造或发卡(hairpin)构造。 tRNA的二级构造——三叶草形 ?氨基酸臂 ?DHU环 ?反暗码环 ?TψC环 ?附加叉 ? tRNA的倒L三级构造 (三)tRNA的3′-终局衔尾氨基酸 ? tRNA的3′-终局都是以CCA收尾。 ? 3′-终局的A与氨基酸共价联贯, tRNA成为了氨基酸的载体。 ? 差别的tRNA能够维系差别的氨基酸。 (四)tRNA的反暗码子识别mRNA的暗码子 3′ 酪氨酸 A C C 5′ ? tRNA 的反暗码子环上有一个由 三个核苷酸组成的反暗码子 (anticodon)。异戊二烯橡胶 ? tRNA 上的反暗码子遵守碱基互 补的法则识别 mRNA 上的暗码 反暗码子 子。 3′ A U G 5′ mRNA UA C 暗码子 三、以rRNA为组分的核卵白体是 卵白质合成的场地 ?核 蛋 白 体 RNA(ribosomal RNA , rRNA) 是 细胞内含量最众的RNA(80%)。 ?rRNA 与 核 蛋 白 体 蛋 白 结 合 组 成 核 蛋 白 体 (ribosome),为卵白质的合成供给场地。 (一)原核、聚异戊二烯真核rRNA分子质地差别 * rRNA的品种(凭据重降系数) 线S rRNA 原核生物 5S rRNA 23S rRNA 16S rRNA 核糖体的构成 原核生物(以大肠杆菌为例) 真核生物(以小鼠肝为例) 小亚基 rRNA 卵白质 16S 21种 30S 1542个核苷酸 占总重量的40% 18S 33种 40S 1874个核苷酸 占总重量的50% 大亚基 rRNA 23S 5S 31种 50S 2940个核苷酸 120个核苷酸 占总重量的30% 28S 5.85S 5S 49种 60S 4718个核苷酸 160个核苷酸 120个核苷酸 占总重量的35% 卵白质 (三)rRNA参预构成的核糖体是卵白质 翻译的场地 rRNA 与核糖体卵白质联合组成核糖体, 是卵白质生物合成的场地:为肽链合成所必要 的mRNA、tRNA、众种卵白因子供给了彼此结 合的位点和彼此效率的空间境遇。 ? 大肠杆菌的核卵白体 23S rRNA 31 proteins 5S rRNA 50S large subunit 70S ribosome 30S small subunit 16S rRNA 21 proteins 四、snmRNA参预了基因外达的调控 ? snmRNAs ? 细胞的差别部位存正在的很众其他品种的小分子RNA, 统 称 为 非 mRNA 小 RNA(small non-messenger RNAs, snmRNAs)。 ? RNA 组学是筹议细胞内 snmRNA 的品种、构造和功 能。同平生物体内差别品种的细胞、统一细胞正在差别 时空形态下snmRNAs外达谱的转移,以及与效力之 间的闭连。 ? snmRNAs的品种 z z z z z 核内小RNA 核仁小RNA 胞质小RNA 催化性小RNA 小片断过问 RNA ? snmRNAs的效力 参预hnRNA的加工剪接 ? 核酶 某些小RNA分子具有催化特定RNA降解 的活性,这种具有催化效率的小RNA亦被称 为 核 酶 (ribozyme) 或 催 化 性RNA(catalytic RNA)。 ? 小片断搅扰RNA ? siRNA是生物宿主对外源侵入的基因外达的双链RNA举办 切割所爆发的特定长度和特定核酸序列的小片断RNA。 ? siRNA能够与外源基因外达的mRNA相维系,并诱发这些 mRNA的降解。 ? 基于此机理,人们发领会RNA搅扰 (RNA interference, RNAi)技巧。 第五节 核酸的理化性子 与星散纯化 五、核酸正在真核细胞和原核细胞中 出现了差别的时空性情 ? 原核生物基因外达的特异性 一、 核酸的分子巨细 ? 采用电子显微镜拍照及放射自显影等技巧,已能测定很众 无缺DNA的分子量。 ? 噬菌体T2DNA的电镜像显示整体分子是一条贯串的细线)μm。由此企图其分子量约为 1×108。 ? 大肠杆菌染色体DNA的放射自显影像为一环状构造,其分 子量约2×109。真核细胞染色体中的DNA分子量更大。 ? 果蝇巨染色体惟有一条线倍。 ? RNA分子比DNA短得众,其分子量只达(2.3~110)×104。 二、 核酸的熔化度与粘度 ? RNA和DNA都是极性化合物,都微溶于水,而不溶于乙醇、 、氯仿等有机溶剂。 ? 它们的钠盐比自正在酸易溶于水,RNA钠盐正在水中熔化度可 达4%。 ? 高分子溶液比通俗溶液粘度要大得众,不原则线团分子比 球形分子的粘度大,而线性分子的粘度更大。 ? 粘度:DNARNA dsDNA ssDNA ? 重降行径:差别构象的核酸分子的重降的速度有很大分歧, 这是超速离心法提取和纯化核酸的外面底子。 三、核酸的酸碱及熔化度性子 z 核酸为众元酸,具有较强的酸性。 四、核酸的紫外接收 核酸正在波长 260nm 处有剧烈的接收,是 由碱基的共轭双键所决策的。这一性情常用作 核酸的定性和定量认识。 ? 碱基的紫外接收光谱 ? 紫外接收的运用 ?DNA或RNA的定量 A260 = 1.0 相当于 50μg/ml 双链DNA(dsDNA) 40μg/ml 单链DNA (ssDNA or RNA) 20μg/ml 寡核苷酸 ?确定样品中核酸的纯度 纯 DNA: A260/A280 = 1.8 纯 RNA: A260/A280 = 2.0 五、DNA变性是双链解离为单链的流程 ? 界说 正在某些理化要素效率下,DNA双链解 开成两条单链的流程。 DNA变性的本色是双链间氢键的断裂。 ? DNA的变性 高温或特别的pH 协同性的DNA解链 ? 局限变性DNA的电镜图像 ? DNA解链时的紫外接收转移 ?增色效应 (hyperchromic effect) : DNA 变 性时其溶液OD260增高的景色。 ? DNA的解链弧线 连 续 加 热 DNA 的 流程中以温度相对待 A260 值作图,所得的 弧线称为解链弧线。 解链温度(melting temperature,凤凰平台登陆地址Tm) 解链流程中,紫外 吸光度的转移到达最大 转移值的一半时所对应 的温度。 ? 解链弧线的转移 ? G+C 含量越高,解链温度就越高。 六、变性的核酸能够复性或造成杂交双链 ?当变性前提迟钝地除去后,两条解离的互补链 可从头配对,光复素来的双螺旋构造,这一现 象称为DNA复性(renaturation) 。 ?热变性的DNA经迟钝冷却后即可复性,这一 流程称为退火(annealing) 。 ?失容效应:DNA复性时,其溶液OD260低落。凤凰平台登陆地址 ? 核酸分子杂交(hybridization) ? 差别品种的DNA单链分子或RNA分子放正在统一 溶液中,只须两种单链分子之间存正在着必定程 度的碱基配对闭连,正在适宜的前提能够正在差别 的分子间造成杂化双链(heteroduplex)。 ? 这种杂化双链能够正在差别的DNA与DNA之间形 成,也能够正在 DNA 和 RNA 分子间或者 RNA 与 RNA分子间造成。这种景色称为核酸分子杂交。 ? 核酸分子杂交 ? 核酸分子杂交的运用 ? 筹议DNA分子中某一种基因的场所。异戊二烯生产厂家 ? 监定两种核酸分子间的序列相像性。 ? 检测某些静心序列正在待检样品中存正在与否。 第六节 核酸的提取与含量测定 一、核酸的提取 ? 提取核酸的通常法则是先碎裂细胞;然后用卵白质变性剂 如苯酚或去垢剂(十二烷基硫酸钠)等,或用卵白酶收拾除 去卵白质;终末将所得到的核酸溶液用乙醇等使其重淀。 ? 正在提取、星散、纯化流程中应更加当心防备核酸的降解。 ? 为了防备内源性核酸酶对核酸的降解,正在提取和星散核酸 时,应尽量低落核酸酶的活性。 ? 核酸的提取流程应正在低温(0℃足下)以及避免激烈搅拌等 前提下举办。 核酸星散纯化的策画及法则 1、连结核酸分子构造的无缺性; 2、尽量清扫其它分子的污染,保障核酸纯度; 应尽量简化星散纯化环节,缩短提取年华 尽量避免各式无益要素对核酸的反对 核酸分子提取的技巧途径 I.资料计算 II.碎裂细胞或包膜-实质物开释 III.核酸星散、纯化 IV.重淀或吸附核酸,并去除杂质 V.核酸熔化正在适量缓冲液或水中 核酸的开释 高速结构捣碎机 呆板法 玻璃匀浆器 研钵 超声匀浆器 细胞碎裂的本领 物理法 冻融法 自溶法 化学法 酶收拾 外面活性剂收拾法 二、核酸的星散与纯化 ? 1. 层析法:羟甲基磷石灰和甲基清卵白硅 藻土柱层析 ? 2. 离心法:差别构象的核酸重降速度差别 ? 3. 凝胶电泳:(1)电荷效应 (2)分子筛效应 该当清扫的杂质紧要征求三局限 1、非核酸的大分子污染物:卵白质、众糖及脂类 物质等 2、非必要的核酸分子:星散某一特定的核酸分子 时,其它的核酸分子皆为杂质; 3、出席的有机溶剂和某些金属离子 二、技巧途径的策画 核酸的浓缩、重淀与洗涤 ? 重淀是浓缩核酸的最常用的本领 ? 常用的盐类有醋酸钠、醋酸钾、醋酸铵、氯化钠、 氯化钾及氯化镁 ? 常用的有机溶剂则为乙醇、异丙醇和聚乙二醇 ? 核酸重淀频频含有少量共重淀的盐,需用70%~75% 的乙醇洗涤去除 核酸的提取流程 碎裂细胞 核酸从细胞中逛离出来 酚和氯仿 重淀核酸 除去卵白质 乙醇 一、酚抽提法 DNA酚抽提法示妄念 基因组DNA的提取 --- 酚抽提法 样品的计算 细胞的裂解 卵白质变性 DNA的抽提 DNA的重淀 血基因组DNA试剂盒 细菌基因组DNA试剂盒 酵母基因组DNA试剂盒 细胞基因组DNA试剂盒 四、真核细胞RNA的星散纯化 一、RNA制备的前提与境遇 ? 采取性地应用RNase的变性剂(如酚、氯仿及剧烈的胍类变 性剂) ? 树立特意RNA移液装备; ? 应用卵白酶K和阴离子去污剂如SDS、十二烷基肌氨酸钠或脱 氧胆酸钠; ? 计算溶液或缓冲液时,应用无RNA酶的器皿,DEPC收拾水等; 细胞RNA的含量 每个细胞的RNA量约为10-5 μg 80%-85% 10%-15% 1%-5% rRNA tRNA mRNA 其他RNA:hnRNA、 snRNA 、snoRNA… 三、核酸的含量测定 ? 1. 定磷法:RNA-9.4%; DNA-9.9% ? 2. 定糖法: DNA:糠醛+地衣酚→深绿色化合物,660nm RNA:ω-羟基-γ-酮基戊醛+二苯胺→蓝色 化合物,595nm ? 3. 紫外接收法 紫外分光光度法:该法是基于核酸分子中的 碱基具有共轭双键构造所以能够接收紫外线nm。 DNA或RNA的定量,OD260=1.0相当于 ? 50μg/ml双链DNA ? 40μg/ml单链DNA(或RNA) ? 20μg/ml寡核苷酸 浓度审定 紫外分光光度法:测定DNA正在A260nm的光接收值。 如企图DNA浓度 A260×稀释倍数×50= μg/ml (A值等于1时,相当于50μg/ml双链DNA, 40μg/ml单链DNA或RNA,20 μ g/ml单链寡核苷酸) 紫外分光光度法只用于测定浓度大于0.25ug/ml的核 酸溶液。 ⑵荧光光度法: 核酸的荧光染料溴化乙锭嵌入碱基平面后,自己 无荧光的核酸正在UV激 发下发出血色荧光,且荧 光强度的积分与溶液中核酸的含量呈正比。 合用于低浓度核酸溶液的定量认识。(1-5ng) 核酸的纯度审定: ⑴ 紫外分光光度法:该法紧要通过A260与 A280 的比值来判断有无卵白质的污染,比 值升高与低落均提示不纯。 鉴定核酸样品的纯度 – DNA纯品: OD260/OD280 = 1.8 – RNA纯品: OD260/OD280 = 2.0 纯DNA 比值1.8,< 1.8 Pr、苯酚污染 纯RNA 比值2.0, 2.0 DNA、 Pr、苯酚污染


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